Autophagy︱杨倩课题组揭示转录因子TFEB入核调控新机制

撰文︱杨绍松，乜铁建

责编︱王思珍，方以一

编辑︱方以一

自噬（autophagy）能够将细胞质内错误折叠蛋白及功能异常的细胞器运送到溶酶体内降解。研究表明在机体衰老过程中自噬活性明显下降，而激活自噬则有助于长寿[1, 2]。卡路里限制（caloric restriction，CR）是自噬最重要的生理性诱导条件，在线虫等动物模型中的研究表明CR能够延长寿命，而通过基因或药物干预等途径抑制自噬将显著抑制CR对衰老的延缓作用[3]，提示CR主要通过自噬发挥抗衰老作用，但CR条件下自噬是如何激活的目前仍不完全清楚。

溶酶体功能的正常是维持自噬活性的重要条件。转录因子EB（transcription factor EB，TFEB）属于碱性碱性螺旋-环-螺旋-亮氨酸拉链（bHLH-Zip）转录因子家族蛋白。研究表明TFEB能够直接结合于溶酶体基因的启动子， 促进溶酶体基因的表达。过表达TFEB 能够显著增加溶酶体数量以及溶酶体酶的表达水平，从而增强溶酶体的功能，协助细胞自噬发生，而敲减TFEB则明显抑制自噬囊泡的降解[4]。在营养物质充足时，TFEB主要以非活性的方式存在于细胞质内。一旦细胞处于饥饿状态或者溶酶体功能受损，TFEB会很快进入细胞核发挥转录作用。磷酸化等翻译后修饰在调节TFEB的空间定位中发挥关键作用，然而关于TFEB具体的入核过程目前仍知之甚少。

2022年8月8日，空军军医大学唐都医院杨倩教授团队在《Autophagy》上发表了题为“Regulation of TFEB nuclear localization by HSP90AA1 promotes autophagy and longevity”的研究，该研究揭示了伴侣分子HSP90AA1能够协同转录因子TFEB入核，进而调节自噬发生，为延缓衰老及治疗衰老相关性疾病提供了新的靶点。

图1 HSP90AA1调节饥饿条件下自噬的诱导

（图源：Yang, et al., Autophagy, 2022）

在饥饿诱导的细胞自噬模型中， 使用HSP90AA1抑制剂17-AAG或Novobiocin，或采用siRNA干扰HSP90AA1的表达均能够明显抑制自噬的活化，表现为阻断p62的降解和LC3B II 的增加；作者将 RFP - GFP - LC3质粒转染细胞，通过免疫荧光检测细胞内自噬流的变化。结果显示，抑制 HSP90AA1的表达及功能能够抑制饥饿条件下细胞内自噬溶酶体的数量（图1）。这些数据表明，HSP90AA1是饥饿促进自噬过程的关键调节蛋白。

图2 HSP90AA1促进TFEB的胞核转位

（图源：Yang, et al., Autophagy, 2022）

TFEB是溶酶体基因转录因子，在自噬活化时可以从细胞浆转入细胞核，启动下游基因表达。作者进行了一系列核浆分离和免疫荧光实验，发现使用17-AAG、novobiocin以及HSP90AA1 siRNA均能明显减弱饥饿诱导的TFEB胞核转位（图2）。

图3 HSP90AA1调节TFEB的转录活性

（图源：Yang, et al., Autophagy, 2022）

为进一步验证 HSP90AA1对于TFEB功能的影响，作者抑制细胞内HSP90AA1的功能后，给予饥饿刺激，检测TFEB靶基因的mRNA表达水平。结果显示，抑制HSP90AA1，能够明显减少饥饿条件下TFEB靶基因的转录（图3）。

图4 HSP90AA1与TFEB相互结合

（图源：Yang, et al., Autophagy, 2022）

在该部分实验中，作者通过免疫共沉淀和蛋白截短体实验证实HSP90AA1通过中间结构域（middle domain）与TFEB互作，并且饥饿刺激信号能明显促进这两种蛋白间的结合，核浆分离后免疫共沉淀实验显示二者的结合主要发生在细胞浆（图4）。

图5 Cdk5抑制饥饿条件下的细胞自噬

（图源：Yang, et al., Autophagy, 2022）

蛋白激酶Cdk5的活化与衰老和神经退行性疾病密切相关，同时也有研究显示Cdk5调节自噬活性，但具体机制仍不清楚。作者发现饥饿刺激条件下细胞内Cdk5激酶活性明显下降；在细胞内过表达Cdk5能够抑制饥饿诱导的自噬发生和自噬流过程（图5）。

图6 Cdk5通过磷酸化HSP90AA1抑制TFEB胞核转位

（图源：Yang, et al., Autophagy, 2022）

蛋白质序列分析发现，HSP90AA1序列中的595位丝氨酸（S595）是Cdk5的潜在磷酸化位点。体外激酶实验证实Cdk5能够直接磷酸化HSP90AA1的S595，且饥饿条件下HSP90AA1的磷酸化程度大大降低。S595磷酸化明显抑制HSP90AA1的功能及其与TFEB的结合。免疫荧光和qPCR显示Cdk5抑制TFEB的胞核转位及转录活性（图6）。

图7 Cdk5通过磷酸化HSP90AA1抑制TFEB胞核转位

（图源：Yang, et al., Autophagy, 2022）

HSP90AA1在线虫的同源基因为hsp-90 。PR673（hsp-90 (p673)）突变，由中科院生物物理所张宏研究院提供）线虫其292位谷氨酸突变为赖氨酸，抑制了hsp-90的功能。饥饿刺激时，p673突变抑制线虫肠道细胞HLH-30（TFEB在线虫体内的同源基因）的胞核富集及其靶基因lmp-1/lamp1、lgg-1/LC3、atg-9及atg-18的表达，自噬小体形成也显著减少。寿命实验显示，p673突变抑制CR对线虫寿命的延长作用；在p673突变的线虫内过表达HLH-30能恢复CR对寿命的调节（图7）。

文章结论与讨论，启发与展望

综上所述，该研究发现伴侣分子HSP90AA1能够与自噬关键转录因子TFEB结合，在饥饿诱导条件下促进去磷酸化的TFEB进入细胞核发挥转录功能，引起一系列自噬相关基因的表达，进而激活自噬。基于序列分析及相关体外磷酸化实验，该研究发现蛋白激酶Cdk5能够磷酸化HSP90AA1序列中的595位丝氨酸，从而抑制HSP90AA1活性，进一步抑制了自噬的发生。在线虫寿命模型中，CR能够激活自噬延长线虫寿命，抑制hsp-90的功能能够明显抑制CR对线虫寿命的延长作用，而当过表达TFEB时，能够恢复CR对于线虫寿命的调节作用。该工作首次发现了Cdk5通过磷酸化修饰调节HSP9AA10活性的具体机制，证实了HSP90AA1通过促进TFEB入核调节自噬活性的具体过程，揭示了HSP90AA1-TFEB-自噬通路在CR调节线虫寿命过程中的重要作用。此外，Cdk5是一种阿尔兹海默病等神经退行性疾病发生过程中的重要蛋白激酶[5]，由此提示我们HSP90AA1-TFEB-自噬通路有很大可能在神经退行性疾病的发生发展过程中发挥了关键性作用。但由于线虫内hsp-90 Ser595突变品系可能为致死品系，本研究未充分验证hsp-90 S595A 突变在线虫寿命调节中的作用，接下来的研究中，从小鼠甚至灵长类动物模型出发或许能够帮助我们更深入认识HSP90AA1磷酸化在CR调节寿命的过程中发挥的作用。

原文链接：10.1080/15548627.2022.2105561

杨倩教授为该论文通讯作者，博士研究生杨绍松（现为解放军总医院神经外科主治医师）和唐都医院乜铁建讲师为论文共同第一作者。该研究获得了国家自然科学基金、科技部重点研发计划等项目的资助。

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参考文献（上下滑动阅读） 

[1] Lipinski MM, Zheng B, Lu T, et al. Genome-wide analysis reveals mechanisms modulating autophagy in normal brain aging and in Alzheimer’s disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 2010;107:14164–14169.

[2] Pyo JO, Yoo SM, Ahn HH, et al. Overexpression of Atg5 in mice activates autophagy and extends lifespan. Nat Commun. 2013;4:2300.

[3] Hou L, Wang D, Chen D, et al. A systems approach to reverse engineer lifespan extension by dietary restriction. Cell Metab. 2016;23:529–540.

[4] Settembre C, Di Malta C, Polito VA, et al. TFEB links autophagy to lysosomal biogenesis. Science. 2011;332:1429–1433.

[5] Cheung ZH, Ip NY. Cdk5: a multifaceted kinase in neurodegenerative diseases. Trends Cell Biol. 2012;22:169–175.

本文完